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为什么跑WB实验每次上样需要煮「蛋白」?
作者:NIRO科研喵 | 2024/9/16 8:36:25 | 浏览:265 | 评论:0

在 WB 实验中,煮蛋白的时间是一个关键的参数,它影响着蛋白质与 SDS 的结合程度、蛋白质的变性程度以及后续电泳的分离效果。

为什么要煮蛋白呢?有什么原理呢?

促进 SDS 与蛋白质的充分结合,SDS 作为阴离子去污剂,能够与蛋白质结合,使其完全变性和解聚,形成带负电荷的棒状结构。这种结构在电场中能够稳定迁移,是电泳分离的基础。
然而,SDS 与蛋白质的结合并非自发进行,需要一定的条件来加速这个过程。高温处理(如煮沸)能够显著提高 SDS 与蛋白质的结合效率,确保蛋白质完全变性和解聚,便于后续蛋白质分子量大小进行分离。
破坏蛋白质的高级结构,蛋白质的高级结构(包括二级、三级和四级结构)是由多种非共价键(如氢键、疏水键、离子键等)维持的。这些高级结构在电泳过程中可能会干扰蛋白质的迁移,导致实验结构不准确。煮沸处理能够破坏这些非共价键,使蛋白质的高级结构解体,转变为线性结构。这样,蛋白质在电泳时的迁移率与分子量大小有关。
为什么跑WB实验每次上样需要煮「蛋白」?
灭活蛋白酶,我们知道蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶类,它们的存在严重干扰 WB 实验结果。在样品制备和处理过程中,如果未能有效灭活蛋白酶,它们可能会降解蛋白质,导致实验结果出现偏差。
煮沸处理是一种有效的灭活蛋白酶的方法,能够确保蛋白质在电泳过程中保持完整,不被降解(防止样品降解)。
提高蛋白样品的稳定性,煮沸处理不仅能够促进 SDS 与蛋白质的结合、破坏蛋白质的高级结构、灭活蛋白酶,还能够提高蛋白样品的稳定性。在高温条件下,蛋白质分子内部的相互作用力减弱,使得蛋白质更加稳定,不易发生聚集或沉淀。此外,煮沸处理还能够去除样品中的气泡和杂质。
确保实验结果的可能性和重复性,每次上样前对蛋白样品进行煮沸处理,能够确保实验条件一致性,从而提高实验结果的可靠性和重复性。如果省略这一步骤,不同批次或不同实验者之间的实验结果可能出现较大差异。


那么,要怎么煮蛋白呢?


煮蛋白的过程通常是将蛋白样品与上样缓冲液(如loading buffer,计算好需要抽出的蛋白质÷4=加入buffer的量,以5×buffer为例,将buffer按照计算量顺序加入有蛋白的EP管中)混合后,在沸水浴或PCR仪中加热至95-100°C,煮3-5 min,加热过程中需要不断摇动或搅拌样品,以确保受热均匀。

除个别蛋白样品外,如膜蛋白不宜高温,一般37℃放置10min,而核蛋白先配平后,不需要进行煮沸,直接离心上样(检测内质网膜蛋白建议使用膜蛋白提取试剂盒,大部分膜蛋白提取试剂盒可以提取细胞器膜,所有膜蛋白均不建议高温煮沸,可梯度变性尝试,如不煮、37℃、70℃进行尝试)。注:建议提取蛋白立马煮蛋白。

值得注意的是,煮蛋白的时间并非固定不变,它可能受到多种因素的影响,如蛋白样品的浓度、上样缓冲液的种类和比例、加热设备的性能等。因此,在实际操作中,可能需要根据具体情况对煮蛋白的时间进行微调。

为什么跑WB实验每次上样需要煮「蛋白」?

图为煮时间过长,出现蛋白沉淀和水分层
(1)煮蛋白时间不宜过长,不然可能会导致蛋白变性,影响后续实验结果;
(2)煮蛋白温度控制在95-100°C之间为宜,常规煮蛋白时间为3-5 min,如果样品浓度过浓时就煮10 min,煮蛋白10 min后,仍然吸不出来,适当增加 Buffer,继续煮,也可以对样品进行超声。若煮样的时间过长,蛋白出现凝固,建议丢了吧,没用了(注:有明显的蛋白沉淀和水分层);
(3)煮蛋白过程中要记得混匀样本,确保样本受热均匀。


蛋白样品如何保存?


4℃离心机中,12000rpm,离心3min中后,将煮完蛋白样品放置-20℃进行储存,最好的情况是分装后放置于-80℃,避免反复冻融,不建议4℃。如果不清楚整个实验流程可以浏览这篇文章《WB全家桶!打破「Western blot 玄学」就看这篇了》。

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