目前已批准上市的CAR-T细胞疗法严重依赖于病毒转导，是一种时间和成本密集型的策略，且可能存在安全问题。相比之下，将体外转录的CAR-mRNA直接转移到T细胞中是CAR-T细胞工程的一种更为简便、安全的策略。电穿孔（EP）目前在临床试验中被用作生成CAR-T细胞的mRNA递送方法，但实际获得的工程化T细胞仅表现出不尽如人意的抗肿瘤活性。

我们曾在“改善基于mRNA的CAR-T生产工艺，“在体CAR”是否是康庄大道？”一文中提到与诺华（Novartis）的CAR-T疗法研发生产合作多年的弗劳恩霍夫细胞治疗和免疫学研究所（IZI）。IZI研究所在Scientific Reports上发表过题为“How to improve mRNA-based CAR-T cell generation and functionality? A lab-scale comparison（如何改善基于mRNA的CAR-T细胞生成和功能？实验室规模的比较）”[1]的文章。该文章通过对常规生产参数的调整，提出了两种优化方案，为mRNA制备CAR-T的工艺流程升级提供参考。该团队经比较实验后认为，基于LNP的转染方式可能是更好的可放大的制备工艺，将显著优于传统电穿孔的方式。

基于这一假设，2023年10月18日，IZI研究所联合Precision NanoSystems在Cell子刊Molecular Therapy - Methods & Clinical Development上在线发表了题为“Lipid Nanoparticles（LNPs）outperform Electroporation in mRNA-based CAR T cell Engineering”的研究论文，进一步对比了常规电穿孔（EP）与LNP在制备CAR-T工程细胞中的不同表现。与EP-CAR-T细胞相比，基于LNP的转染方式在体外增加了T细胞的活性，延长了CAR的表达时间，且增殖速度更为平缓，显著增强了CAR-T细胞的持久疗效。

来源:参考资料[2]

对比EP与LNP的mRNA转染

研究人员从CAR表达量、mRNA表达时间、CAR-T细胞功能性三个方面进行了对比实验，表征两种转染方法的差异。

为获得最优化的EP条件以和LNP方法进行比较，研究人员使用了不同的电穿孔设备，手动调整包括脉冲电压、精度等影响细胞通透性的参数，结果显示，在1600V，10ms，3脉冲条件下的电穿孔可获得最大细胞活性和较高的基因表达水平的CAR-T细胞。

LNP封装CAR-mRNA采用了商业GenVoy-ILMTM T细胞试剂盒。该T细胞试剂盒在基于mRNA的CAR-T细胞工程中比两种临床批准的LNPs的脂质成分更有效，对细胞活性的影响更小。需要添加载脂蛋白E4（ApoE4）才能使LNP成功转染T细胞，并观察到CAR的表达。该试剂盒条件下获得的LNP包封率约为96.8%，直径约为78.3 nm，多分散系数（PDI）约为0.201。6µg CAR-mRNA每106个T细胞作为LNP转染T细胞的最佳剂量，可维持高CAR表达和细胞活性。

转染后CAR-T细胞功能对比

本研究中使用了抗f（ab’）2-AlexaFluor647试剂孵育细胞，作为CAR表达强度指标，检测细胞表面的CAR表达。

在电穿孔组中，转染后6h即达到表达峰值，观察到有92%的T细胞表面有高强度CAR表达，表明电穿孔实现了快速有效的mRNA转染。但中位荧光强度（MFI）在1天后就显著降低，此后表达CAR的细胞比例快速下降，在第3天时低于10%（图1A）。

相较之下，LNP转染的细胞，其最大中位荧光强度（即最大CAR表达强度）显著低于EP转染。LNP转染1天后CAR表达才达到峰值，检测到84%的细胞表达CAR。这一结果表明，LNP转染后mRNA的表达较EP的更慢。然而，总RNA提取和qPCR分析显示，LNP转染的细胞内CAR-mRNA水平较EP转染的更高（图1C）。此外，转染2天后，LNP转染的细胞CAR表达量持续高于EP转染，直到6天后表达CAR的细胞比例才低于10%。

图1. 转染后CAR-T细胞功能对比

研究人员分析，这些结果可能是由两个原因导致的：

1）转染后部分mRNA仍被包覆在LNP中，未能及时表达CAR蛋白；

2）尽管EP可一次性转染大量mRNA，但快速的翻译导致了大量mRNA降解。

LNP转染的T细胞治疗活性与转染后CAR的表达时间一样较EP转染延长了3天。此外，LNP转染的T细胞针对表达CD123的KG-1细胞毒性下降也更为缓慢。尽管EP转染T细胞的细胞毒性在6h后就达到最大值83%，而LNP转染T细胞在1天后才达到最大值且为76%，低于EP，但具备细胞毒性的EP转染T细胞的在第3天就已经不足10%（图1D）。

因此，LNP转染的T细胞中，CAR-mRNA的表达时间将更长，且转染的CAR-mRNA水平更高，针对表达CD123的KG-1细胞的细胞毒性将更为持久。

转染后T细胞表型、活性和脱靶毒性对比

研究人员通过测量T细胞表面标记物来检测转然后T细胞的表型，包括T细胞亚型（CD3,CD4,CD8），激活（CD25）和衰竭（LAG-3）。结果显示，CD3表达和CD8+细胞毒性T细胞在两种转染方式中均未受到影响，CD4+辅助T细胞有略微下降，而CD4+CD8+T细胞则在两者中均显著增加，证明转染后CD4+辅助T细胞向CD4+CD8+T细胞的转变。同时，CAR-T细胞表面CD25表达的增加也证明转染后T细胞大量转变为激活表型。然而，EP转染的T细胞中LAG-3表达较LNP转染的更高，略微增加了T细胞的衰竭（图2A）。

对比可得出，EP或LNP转染在对T细胞的表型、激活和衰竭上无显著差异。

图2. 转染后T细胞表型、活性和脱靶毒性对比

通过对膜联蛋白（Annexin）V和7-AAD的双阴性分析，可以检测转染后T细胞的活性，细胞凋亡时Annexin V为阳性，细胞死亡时两者均为阳性（图2B）。根据图2C显示，EP-CAR-T细胞在0.25天（6h）时的细胞活性显著低于LNP-CAR-T（40% EP:65% LNP），且在1天后差距更大（46% EP:72% LNP）。这一结果表明，EP转染较LNP更容易降低T细胞活性，损耗细胞。

作为对照的Mock-CAR T组显示出较所有转染组更好的T细胞存活率，表明CAR细胞内激活域的强直信号（Tonic signaling）将对T细胞活性产生负面影响。由于强制信号可能导致非特异性毒性，研究人员测试了转染后CAR-T细胞对CD123阴性K562是否也会表现细胞毒性（图2D）。可以观察到，相较于未转染的T细胞，转染后CAR-T细胞具有较高的细胞毒性。

然而，对比转染1天后的细胞毒性，EP-CAR-T对K-562细胞的毒性明显强于LNP-CAR-T。转染第3天后，两者的非特异性细胞毒性均下降到与未转染T细胞一样的水平。该结果证明，mRNA工程化CAR-T细胞对非靶细胞具有短暂影响，但LNP方法在转染1天后相较于EP更为安全。

在此基础上，研究人员进一步测试了CAR-T细胞在靶细胞和非靶细胞分别或共同存在时的特性（图3）。由于CAR-T细胞识别靶细胞时的抗原依赖性增殖会影响CAR的表达动力学，研究人员设置了包含KG-1和K-562或分别只含单种细胞的试验组，对比CAR表达和CAR-T细胞的增殖差异。

两组CAR-T在转染1天后具有相似表达量，然而研究人员观察到，LNP-CAR-T的CAR表达在KG-1细胞中的后3天内和在K-562细胞中的后2天内均比EP-CAR-T有更显著的提高，表明LNP-CAR-T具有更持久的CAR表达（图3A, B）。与之相对的，两组CAR-T在KG-1和K-562中的细胞增殖都显示增加，证明T细胞的抗原依赖性增殖可能是由CAR介导的T细胞活化诱导的（图3C, D）。

图3. CAR表达和CAR-T细胞增殖的差异

总结

本研究使用了相同的CAR构象、mRNA设计、mRNA数量、细胞计数、转染时间和T细胞扩展条件头对头比较了基于mRNA的电穿孔转染以及LNP转染两种方式的实际效用。LNP转染方式相较之下在延长CAR表达，降低T细胞毒性，延缓T细胞增殖减少细胞衰竭上具有更好的效益。

此外，LNP-mRNA的可制造性和可扩展性更具备成本和时间效益。作为一个灵活的平台，LNP-mRNA不需要改变制造过程和LNP配方，仅需改变序列设计即可筛选、生成不同的CAR-T细胞，为临床提供了方便、及时的生产制备途径。

参考资料

[1]Nadine Auw, Robert Serfling, Reni Kitte et al. How to improve mRNA-based CAR-T cell generation and functionality? A lab-scale comparison, 05 April 2023, PREPRINT（Version 1）available at Research Square. doi:10.21203/rs.3.rs-2719850/v1.

[2]https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/fulltext/S2329-0501（23）00178-X#%20