我们的马拉松授课环节里面的表达量芯片通常是2分组，所以简单的差异分析即可！但实际科研场景经常是多分组的更复杂的生物学问题，例如时间序列分析、剂量反应、不同条件下的比较等。以下是一些常见的多分组实验设计：

时间序列分析：
在这种设计中，可能会在不同的时间点对同一生物样本进行多次测量，以观察基因表达随时间的变化。
剂量-反应研究：
研究不同剂量的药物或化学物质对生物样本的影响，通常会包括多个剂量水平的分组。
不同条件/处理的比较：
比如研究不同环境条件（如温度、pH值、光照）、营养物质、应激因素（如氧化应激、机械应力）等对基因表达的影响。
发育阶段分析：
比较不同发育阶段（如胚胎期、幼年期、成年期、老年期）的基因表达差异。
组织类型比较：
对不同组织类型（如肝脏、心脏、肌肉、大脑）的基因表达进行比较。
疾病状态与正常状态的比较：
除了疾病组和正常对照组，还可能包括疾病发展的不同阶段或不同亚型的分组。
药物处理与对照组的比较：
除了药物处理组和未处理的对照组，还可能包括不同药物、不同时间点、不同给药方式等多个分组。
基因敲除与野生型比较：
在基因敲除（KO）和野生型（WT）的基础上，可能还会包括基因敲除后的不同处理组，如基因敲除后的药物处理组。
多因素实验设计：
同时考虑多个因素（如基因型、环境、时间）对基因表达的影响，这种设计通常会产生大量的分组。
交叉设计：
在这种设计中，不同的实验组可能会在不同的时间点或条件下接受不同的处理。
在处理多分组数据时，研究者需要使用更复杂的统计方法来分析数据，如多元方差分析（MANOVA）、混合效应模型、多重比较校正等。这些方法可以帮助研究者从复杂的数据中提取有意义的生物学信息，并控制多重比较导致的假阳性结果。

哪怕是研究单一目标也可以多分组
常见的转录组实验设计就是干扰一下目标基因，然后两分组每个组内3个样品，是因为早期转录组测序费用昂贵。如果是二十年前做一个转录组样品可能会过万的费用，十年前就千把块钱了，五年前就五六百块钱，现在就三百多块钱了。详见：转录组价格腰斩哈！（优化升级后单个样本仅399元）。所以，建议大家敲减过表达前后转录组差异最好是都做一下，向CNS期刊看齐！比如2024的CELL文章：《A TCF4-dependent gene regulatory network confers resistance to immunotherapy in melanoma》

但是多分组，就可以两两组合的差异分析，结果很复杂， 比如文献这个新鲜出炉的文献，. Int J Biol Sci. 2024 Feb ：《Hspb1 protects against severe acute pancreatitis by attenuating apoptosis and ferroptosis via interacting with Anxa2 to restore the antioxidative activity of Prdx1 》，如下所示的差异分析组合：

差异分析组合
急性胰腺炎（Acute Pancreatitis, AP）是一种涉及胰腺炎症的疾病，其特征是胰腺消化酶的异常激活，导致胰腺自身和周围组织的损伤。根据疾病的严重程度和临床表现，急性胰腺炎可以分为轻度、中度和重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis, SAP）。

急性胰腺炎（AP）：
病因：可能由多种因素引起，包括胆结石、酒精滥用、高脂血症、某些药物、感染和自身免疫性疾病等。
临床表现：通常包括急性腹痛（通常是剧烈的、持续的、位于上腹部）、恶心、呕吐、发热和腹部压痛。
治疗：轻度和中度的AP通常可以通过保守治疗（如禁食、补液、止痛和营养支持）来管理。
重症急性胰腺炎（SAP）：
定义：SAP是AP的一种严重形式，伴有持续的器官功能障碍、局部并发症（如胰腺坏死）或全身炎症反应综合征（Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS）。
并发症：可能包括胰腺坏死、感染、胰周脓肿、假性囊肿、胃肠道出血、多器官功能衰竭等。
风险因素：包括年龄、合并症、疾病严重程度、感染和治疗延迟等。
治疗：除了AP的保守治疗外，SAP可能需要更积极的干预，如抗生素治疗、内镜治疗、经皮引流、手术干预以及重症监护。
进展关系：
炎症反应：AP的炎症反应可能导致胰腺组织的进一步损伤，如果没有及时控制，可能会进展为SAP。
器官功能障碍：AP患者可能会出现一过性的器官功能障碍，但如果这些功能障碍持续存在或加重，可能表明疾病正在进展为SAP。
局部并发症：胰腺坏死和感染是SAP的特征性并发症，这些并发症的出现通常标志着疾病的严重程度增加。
全身炎症反应：SAP患者可能会发展出全身炎症反应，这可能导致多器官功能衰竭，是SAP患者死亡的主要原因之一。
如何整理两次差异分析的结果呢
可以看到，文献里面是挑选了那些在急性胰腺炎（AP）是高表达但是在重症急性胰腺炎（SAP）组里面又重新降低回去了的基因列表作为后续的分析目标，如下所示：

后续的分析目标
可惜的是这个文章并没有给出来表达量矩阵，但是我们可以找到很多类似的3分组实验设计！比如下面的这个文章也是三分组，但是研究者关注的并不是先上升然后下降的基因，而是先上升然后保持上升的基因，如下所示：

先上升然后保持上升的基因
其实可以有9种变化趋势
如果进行了两次独立的差异表达分析，每次分析都将基因分为上调、下调和不变三类，那么确实可以存在多种不同的组合情况。这些组合反映了两次分析中基因表达变化的一致性和差异性。 以下是两次差异表达分析中基因可能的九种不同组合：

基因在第一次分析中上调，在第二次分析中也上调。
基因在第一次分析中上调，在第二次分析中下调。
基因在第一次分析中上调，在第二次分析中不变。
基因在第一次分析中下调，在第二次分析中也下调。
基因在第一次分析中下调，在第二次分析中上调。
基因在第一次分析中下调，在第二次分析中不变。
基因在第一次分析中不变，在第二次分析中上调。
基因在第一次分析中不变，在第二次分析中下调。
基因在两次分析中都不变。
不同的实验设计决定了我们选择哪个组合的基因列表去做后续的分析，前面的急性胰腺炎（AP）发展为重症急性胰腺炎（SAP）是有时间顺序，但是后面的药物处理浓度高低是独立的事件。

如何比较两次差异分析结果呢，代码可以参考：剔除了两个样品前后的差异分析结果没什么区别？

当然了，更高级的分析是mfuzz等时间序列方法！