第一作者：Deyi Wang

通讯作者：Ning Gao; Zehuan Huang

单      位：北京理工大学化学与化学工程学院；北京大学材料科学与工程学院

Part 1 研究背景

   生物分子凝聚体（也称为无膜细胞器）是通过液-液相分离（LLPS）形成的超分子集合，在细胞组织和代谢网络中发挥着关键作用。LLPS及其相关的组装和去组装过程通常受超分子相互作用的调节。内在无序蛋白（IDPs）是能够经历LLPS的主要生物分子类别。尽管IDPs的组装机制尚未完全阐明，但普遍认为超分子相互作用是IDPs LLPS的主要驱动力。LLPS和相关的生物分子凝聚体组装/去组装过程是动态和可逆的，依赖于动态LLPS来执行生物学功能。重建动态LLPS系统对于理解细胞组织、分析细胞功能和设计生物启发材料具有重要意义。但由于IDPs的复杂和无序结构以及它们结构的快速变化，重建受超分子调节的动态LLPS系统并定量说明分子相互作用的变异性具有挑战性。

Part 2 文章简介

   本文主要研究了一种名为Nap-o-Nap的简化相分离分子，该分子能够在生理条件下发生液-液相分离（LLPS），并通过与Cucurbit[7]uril和1-Adamantylamine的竞争性主-客体相互作用，实现相分离的可逆调控。这种调控方法不仅能够定量地阐明LLPS过程中分子间相互作用的变异性，还能通过选择性地招募或排除客户分子来调节酶的活性，从而编排生物酶动力学。

示意图. Nap-o-Nap的LLPS与超分子开关的可逆LLPS

Part 3 本文要点

图1. Nap-o-Nap分子在进行液-液相分离（LLPS）的过程及其相关特性

要点一：当Nap-o-Nap分子被加入到去离子水或含水盐溶液中，并经过超声或剧烈震动后，溶液变得浑浊，形成了直径为1-3微米的共凝聚微滴。在微滴接触时，它们会自发融合成更大的微滴，并最终在几秒钟内变形为球形。通过荧光恢复后漂白（FRAP）实验，观察到微滴被光漂白后荧光强度迅速恢复，10秒内恢复到约94.5%的原值，证实了微滴的液体性质。通过核磁共振（NMR）和溶剂蒸发法，定量分析了浓缩相和上清相的组成，发现浓缩相主要由Nap-o-Nap和水组成，而上清相几乎不含Nap-o-Nap，表明了明显的浓度梯度。浊度测量，观察到Nap-o-Nap共凝聚微滴在pH值低于7.5时为均匀溶液，而在pH值约为7.5时发生LLPS。Zeta电位测量显示，随着pH值的降低，Zeta电位略有下降，表明从LLPS到均匀溶液的相变。

图2. Nap-o-Nap 共聚物微滴的多相分离与分子选择性富集

要点二：作者过将Nap-o-Nap溶液与不同体积的共溶剂（DMF）混合，实现了多相分离，形成了具有不同形态的多相共聚物微滴。随着DMF浓度的降低而变化，这些微滴的形态从Janus形、碗形到多相结构。激光扫描显微镜（CLSM）观察到，这些多相微滴保持了共聚物的特性，如球形结构、荧光恢复实验（FRAP）和荧光富集特性。将Nap-o-Nap共聚物微滴与各种客体分子（如Rhodamine 6G、Thioflavine T、Calcein、Fluorescein、Rhodamine B、Nile Red、Lipase、β-Galactosidase和Dextran）混合，证明了共聚物微滴对各种分子的选择性富集能力，特别是那些具有疏水特性和芳香基团的分子。

图3. 超分子调控实现的液-液相分离（LLPS）的组装、解组装和再组装循环

要点三：首先，Nap-o-Nap在水中发生相分离，形成浑浊的溶液，随后加入CB[7]导致共聚物解组装，溶液变清。接着，加入Ada使溶液重新变浑浊，表明共聚物重新组装。通过添加CB[7]和Ada实现的动态LLPS循环。随着CB[7]和Ada的添加，溶液的浊度变化，表明共聚物的组装和解组装循环。过1H NMR光谱验证CB[7]、naphthalene和Ada之间的主-客体相互作用。当CB[7]加入Nap-o-Nap共聚物时，naphthyl质子峰变窄并上移，表明naphthyl基团被封装在CB[7]腔内。加入Ada后，质子峰再次变宽，表明LLPS发生。等温滴定热法（ITC）定量分析LLPS过程中分子相互作用的变化。结果显示，主-客体结合能（ΔGx）高于Nap-o-Nap的LLPS结合能（ΔGz），表明LLPS过程主要受熵驱动。通过添加CB[7]和Ada实现的多相共聚物的组装、解组装和再组装循环。这表明超分子调控对多相分离微滴也有效。

图4. 超分子调控液-液相分离（LLPS）来调节酶反应

要点四：作者通过LLPS调节酯酶催化的4-硝基苯己酸（4-NH）的水解反应。在三种不同系统（LLPS系统、非LLPS系统、LLPS后重新组装的系统）中4-NH水解反应的动力学曲线。显示了三种系统中酶反应的平均水解速率有所不同，在LLPS系统中，酶反应速率加快；在非LLPS系统中，酶反应速率减慢；在LLPS后重新组装的系统，酶反应速率恢复。在LLPS系统中，通过引入CB[7]和Ada来动态调控酶反应的过程。首先，引入CB[7]使LLPS解体，酶反应速率降低；然后，引入Ada重新组装LLPS，酶反应速率恢复。作者又进行了β-半乳糖苷酶催化的p-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）水解反应的方案。通过测试三种系统中pNPG水解反应的动力学曲线。发现三种系统中酶反应的平均水解速率。在LLPS系统中，酶反应速率减慢；在非LLPS系统中，酶反应速率加快；在LLPS后重新组装的系统，酶反应速率恢复。在LLPS系统中，通过引入CB[7]和Ada来动态调控酶反应的过程。首先，引入pNPG启动酶反应，然后引入CB[7]使LLPS解体，酶反应速率加快；最后，引入Ada重新组装LLPS，酶反应速率恢复。

Part 4 总结与展望

   本文通过设计一种名为Nap-o-Nap的小分子，实现了可逆的液-液相分离（LLPS），并通过主客体相互作用调节其相分离过程。研究发现，LLPS过程主要受熵驱动，且主客体相互作用比Nap-o-Nap的相分离更强，从而实现了对LLPS过程的调节。利用这种可调节的LLPS，可以有效地调控酶的活性，从而操控生物酶的动力学，为设计细胞模拟生物材料提供了新的思路。

原文链接

https://doi.org/10.1002/anie.202422601