在 WB 实验中，煮蛋白的时间是一个关键的参数，它影响着蛋白质与 SDS 的结合程度、蛋白质的变性程度以及后续电泳的分离效果。

为什么要煮蛋白呢？有什么原理呢？

促进 SDS 与蛋白质的充分结合，SDS 作为阴离子去污剂，能够与蛋白质结合，使其完全变性和解聚，形成带负电荷的棒状结构。这种结构在电场中能够稳定迁移，是电泳分离的基础。
然而，SDS 与蛋白质的结合并非自发进行，需要一定的条件来加速这个过程。高温处理（如煮沸）能够显著提高 SDS 与蛋白质的结合效率，确保蛋白质完全变性和解聚，便于后续蛋白质分子量大小进行分离。
破坏蛋白质的高级结构，蛋白质的高级结构（包括二级、三级和四级结构）是由多种非共价键（如氢键、疏水键、离子键等）维持的。这些高级结构在电泳过程中可能会干扰蛋白质的迁移，导致实验结构不准确。煮沸处理能够破坏这些非共价键，使蛋白质的高级结构解体，转变为线性结构。这样，蛋白质在电泳时的迁移率与分子量大小有关。

灭活蛋白酶，我们知道蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶类，它们的存在严重干扰 WB 实验结果。在样品制备和处理过程中，如果未能有效灭活蛋白酶，它们可能会降解蛋白质，导致实验结果出现偏差。
煮沸处理是一种有效的灭活蛋白酶的方法，能够确保蛋白质在电泳过程中保持完整，不被降解（防止样品降解）。
提高蛋白样品的稳定性，煮沸处理不仅能够促进 SDS 与蛋白质的结合、破坏蛋白质的高级结构、灭活蛋白酶，还能够提高蛋白样品的稳定性。在高温条件下，蛋白质分子内部的相互作用力减弱，使得蛋白质更加稳定，不易发生聚集或沉淀。此外，煮沸处理还能够去除样品中的气泡和杂质。
确保实验结果的可能性和重复性，每次上样前对蛋白样品进行煮沸处理，能够确保实验条件一致性，从而提高实验结果的可靠性和重复性。如果省略这一步骤，不同批次或不同实验者之间的实验结果可能出现较大差异。

那么，要怎么煮蛋白呢？

煮蛋白的过程通常是将蛋白样品与上样缓冲液（如loading buffer，计算好需要抽出的蛋白质÷4=加入buffer的量，以5×buffer为例，将buffer按照计算量顺序加入有蛋白的EP管中）混合后，在沸水浴或PCR仪中加热至95-100°C，煮3-5 min，加热过程中需要不断摇动或搅拌样品，以确保受热均匀。

除个别蛋白样品外，如膜蛋白不宜高温，一般37℃放置10min，而核蛋白先配平后，不需要进行煮沸，直接离心上样（检测内质网膜蛋白建议使用膜蛋白提取试剂盒，大部分膜蛋白提取试剂盒可以提取细胞器膜，所有膜蛋白均不建议高温煮沸，可梯度变性尝试，如不煮、37℃、70℃进行尝试）。注：建议提取蛋白立马煮蛋白。

值得注意的是，煮蛋白的时间并非固定不变，它可能受到多种因素的影响，如蛋白样品的浓度、上样缓冲液的种类和比例、加热设备的性能等。因此，在实际操作中，可能需要根据具体情况对煮蛋白的时间进行微调。

图为煮时间过长，出现蛋白沉淀和水分层
（1）煮蛋白时间不宜过长，不然可能会导致蛋白变性，影响后续实验结果；
（2）煮蛋白温度控制在95-100°C之间为宜，常规煮蛋白时间为3-5 min，如果样品浓度过浓时就煮10 min，煮蛋白10 min后，仍然吸不出来，适当增加 Buffer，继续煮，也可以对样品进行超声。若煮样的时间过长，蛋白出现凝固，建议丢了吧，没用了（注：有明显的蛋白沉淀和水分层）；
（3）煮蛋白过程中要记得混匀样本，确保样本受热均匀。

蛋白样品如何保存？

4℃离心机中，12000rpm，离心3min中后，将煮完蛋白样品放置-20℃进行储存，最好的情况是分装后放置于-80℃，避免反复冻融，不建议4℃。如果不清楚整个实验流程可以浏览这篇文章《WB全家桶！打破「Western blot 玄学」就看这篇了》。